scFv和載體DNA的連接

[器材和試劑]●T4DNA連接酶及10×緩沖液（NEB）●酚/氯仿（Sigma）●100%和70%乙醇，-20℃保存●消化的載體和scFv文庫(kù)●TE（10mmol/LTrispH8，lmmol/LEDTA）[方法]1.如下所述，配制兩個(gè)100ul連接混合液，其中1個(gè)用于VH-VκscFv文庫(kù)，另1個(gè)用于Vu-VλscFv文庫(kù)，并設(shè)置兩個(gè)對(duì)照反應(yīng)。對(duì)照可以確定未切的載體有多少（對(duì)照2），以及確定無(wú)插入序列時(shí)有多少重新連接的載體（對(duì)照1）。要保持恰當(dāng)?shù)谋壤@得的克隆數(shù)（對(duì)于相...

電感受態(tài)大腸桿菌TGl的制備

[方法]1．將大腸桿菌TG1種到基本培養(yǎng)瓊脂板，37℃過夜。2．將基本培養(yǎng)瓊脂板上的大腸桿菌TGl再接種到含有15m12XTY培養(yǎng)基的100ml形瓶中。37℃振蕩培養(yǎng)過夜。3．用5ml夜培養(yǎng)的TGl接種到兩個(gè)含500m12×Y培養(yǎng)基的2L有擋板錐形瓶中。在搖床中培養(yǎng)約1．5小時(shí)，直到A600接近0．5。4．將菌液轉(zhuǎn)移4個(gè)預(yù)冷離心瓶中（約250ml/瓶）。平衡后，置于冰上20分鐘。5．以3000g，4℃離心15分鐘。使用前預(yù)冷所有轉(zhuǎn)頭。6，棄去上清，并以起始體積的冰冷lmmol...

在微量滴定板中表達(dá)可溶性scFv

[器材和試劑]●用于細(xì)菌培養(yǎng)的96孔圓底微量滴定板（Nunc，目錄號(hào)62162）●含100ug/ml氨芐青霉素和0．1％葡萄糖的2XTY培養(yǎng)基（2×TY/amp/0．1％glu）●含100ug/ml氨芐青霉素和3mmol/LIPTG的2XTY培養(yǎng)基（2×TY/amp/glu/IPTG）（參見實(shí)驗(yàn)方案13．10）●噬菌體樣品[方法]1．用96孔無(wú)菌轉(zhuǎn)移設(shè)備或移液器從主板中，每孔取2ul；而后轉(zhuǎn)移至1個(gè)每孔含有100ul2×TY/amp/0.1％glu的無(wú)菌96孔微量滴定板中。2...

用PCR識(shí)別不同的噬菌體抗體克隆

[方法]1．配制PCR“主混合液”，每克隆20ulPCR混合液，包含：●水，15．5ul●10XRT緩沖液，2．0ul●5mmol／LdNTP，1．0ul●5，引物，1．0ul●3，引物，1．0ul●Taq聚合酶，0.2ul如果PCR緩沖液中不含Mg2+，這應(yīng)加至終濃度為1．5mmol／L。也可以使用與DNA聚合酶配套供應(yīng)的PCR試劑。2．取20fLl主混合液加到0．5m1管內(nèi)，或加入96孔PCR微孔板孔內(nèi)。3．用l根牙簽輕輕接觸單個(gè)克隆并在PCR反應(yīng)液中轉(zhuǎn)動(dòng)，注意不要轉(zhuǎn)移太...

再擴(kuò)增SCFvVLCDR3基因文庫(kù)

[器材和試劑]●PCR試劑和設(shè)備●WinardPCR純化試劑盒（Promega）●定制的DNA引物●VL—NotI引物（5，—GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGCACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAACACCCAACC—3’）●LMB3引物●用于scFv基因文庫(kù)限制性消化的試劑和設(shè)備●已擴(kuò)增的scFv基因文庫(kù)DNA[方法]1．配制4個(gè)50ulPCR反應(yīng)混合液，包含：●去離子水，35．5ul●20×dNTP（每種5mmol/L），2．5u...

連接scFv和載體DNA并轉(zhuǎn)化大腸桿菌

[器材和試劑]●去離子水（millipore）●T4DNA連接酶和10×連接酶緩沖液（NEB）●16℃水浴●消化的scFv文庫(kù)DNA●pHENlDNA，用NcoI和NotI消化（100ng／ul）●電感受態(tài)大腸桿菌TGl細(xì)胞（Strataeene）●用于將scFv文庫(kù)電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl株的試劑和設(shè)備[方法]1．配制1個(gè)50ul連接混合液，包含：●10×連接緩沖液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的...

平衡法選擇高親和力噬菌體抗體

1．多樣化的噬菌體抗體丈庫(kù)中制備噬菌體抗體。2．根據(jù)廠家說明，對(duì)抗原進(jìn)行生物素化。3．選擇前，在1個(gè)1．5m1微量離心管中．用2％MPBS1m1封閉150ul鏈霉親和素磁珠，室溫1小時(shí)。用磁性試管架將碰珠吸向一側(cè)。棄去緩沖液。4．用2％MPBS封閉3個(gè)1．5m1微量離心管，室溫1小時(shí)；而后，棄去封閉緩沖液。以3個(gè)不同濃度將士物素化抗原（總共3管）與溶于2％MPDS（終濃度）的1m1噬茼體樣品（大約1012c{u／m1）進(jìn)行孵育，室溫振蕩l小時(shí)。對(duì)于*輪選擇，抗原濃度應(yīng)分別為K...

用Biacore儀篩選解離速率較低的scFv

選擇3～5輪后，隨機(jī)挑取克隆加入96孔微量滴定板中并誘導(dǎo)表達(dá)可溶性scFv。然后，在包被有相關(guān)抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的細(xì)菌上清。此過程可以識(shí)別出那些結(jié)合了抗原的scFv。但即便采用上述嚴(yán)謹(jǐn)性選擇后，ELISA陽(yáng)性克隆中僅有部分克隆的親和力比野生型高。ELISA信號(hào)強(qiáng)度不能很好地顯示哪個(gè)克隆具有較低的Ka值，而且更為普遍的是它與scFv表達(dá)水平相關(guān)。因此，這就需要一種篩選ELISA陽(yáng)性克隆的技術(shù)，能識(shí)別出具有較低Ka值的克隆。競(jìng)爭(zhēng)性或抑制性...