在微量滴定板中表達(dá)可溶性scFv

[器材和試劑]
● 用于細(xì)菌培養(yǎng)的96孔圓底微量滴定板 （Nunc， 目錄號(hào)62162）
● 含100ug/ml氨芐青霉素和0．1％葡萄糖的2XTY培養(yǎng)基（2 ×TY/amp/
0．1％glu）
● 含100ug/ml氨芐青霉素和3mmol/L IPTG的2XTY培養(yǎng)基（2×TY/amp/glu/IPTG）（參見實(shí)驗(yàn)方案13．10）
● 噬菌體樣品

[方法]
1．用96孔無菌轉(zhuǎn)移設(shè)備或移液器從主板中，每孔取2ul；而后轉(zhuǎn)移至1個(gè)每孔含有100ul 2×TY/amp/0.1％glu的無菌96孔微量滴定板中。
2．將孔板在37℃振蕩孵育，直到A600值約為0．9（通常需2～3小時(shí)）。
3．每孔加50ul 2XTY/amp/glu/IPTG（zui終IPTG濃度為lmmol/L）。繼續(xù)將孔板在30℃振蕩16小時(shí)。
4．以2700r/min離心孔板15分鐘；取上清可進(jìn)行ELISA.

純化scFv片段zui簡單的方式是：在其C末端添加六組氨酸標(biāo)簽，再用固相金屬離子親和層析（1MAC）進(jìn)行蛋白純化。大多數(shù)用于IMAC的試劑現(xiàn)在已加工為試劑盒銷售，并附有詳盡的說明。不過，應(yīng)當(dāng)注意的是，試劑盒中所提供的實(shí)驗(yàn)方案也許要根據(jù)不同的scFv載體構(gòu)建類型加以調(diào)整。例如，我們發(fā)現(xiàn)：對在His標(biāo)簽前帶有myc標(biāo)簽的scFv洗滌時(shí)，該咪唑濃度（20mmol／L）比攜帶了其他標(biāo)簽的scFv的咪唑洗滌濃度（5mmol／L）更高一些。
www.sydney4dlotto.com