用PCR識(shí)別不同的噬菌體抗體克隆

[方法]
1．配制PCR“主混合液”，每克隆20ul PCR混合液， 包含：
● 水，15．5ul
● 10XRT緩沖液，2．0ul
● 5mmol／L dNTP， 1．0ul
● 5，引物，1．0ul
● 3，引物，1．0ul
● Taq聚合酶，0.2ul
如果PCR緩沖液中不含Mg2+，這應(yīng)加至終濃度為1．5mmol／L。也可以使用與DNA聚合酶配套供應(yīng)的PCR試劑。
2．取20fLl主混合液加到0．5m1管內(nèi)，或加入96孔PCR微孔板孔內(nèi)。
3．用l根牙簽輕輕接觸單個(gè)克隆并在PCR反應(yīng)液中轉(zhuǎn)動(dòng)，注意不要轉(zhuǎn)移太多材料。如在PCR反應(yīng)液中有過(guò)量細(xì)菌，會(huì)抑制PCR反應(yīng)。扔掉牙簽；或如有需要，用它在1個(gè)單獨(dú)的96孔培養(yǎng)孔板內(nèi)培養(yǎng)基救援該克隆；或者在瓊脂平板上接觸表面。用1～2ul甘油儲(chǔ)存料或主板培養(yǎng)液，也可以代替相應(yīng)克隆。
4．反應(yīng)液上鋪上礦物油。
5．用PCR儀格內(nèi)加熱試管或孔板至94℃，10分鐘。裂解細(xì)菌使其釋放模板DNA。然后，以94℃1分鐘、55～60℃1分鐘（對(duì)于Fab片段文庫(kù)的篩選則為2分鐘）、72℃ 1分鐘的條件孵育，共循環(huán)30次。
6．建議在PCR后取5ul PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2％瓊脂糖膠上檢測(cè)。這將顯示有多少克隆包含全長(zhǎng)的插入序列。
7．PCR后，在礦物油下面加入20ul主混合液，成分如下：
● 乙酰化BSA（10mg／ml）， 0．2ul
● BstNⅠ緩沖液（10×），4．0ul
● 水，15．3ul
● BstNⅠ （10U／ul），0．54ul
8．60℃孵育樣本2～3小時(shí)。
9．將2ul樣本染液與8ul反應(yīng)混合物（取自礦物油下面）混合并在4％Nusieve瓊脂糖膠上電泳；此膠用含0．05ug／ml溴化乙錠的0．5倍TBE緩沖液配制。或者是用2．5％瓊脂糖膠電泳（此膠的分辨率較低）。
10．以100V（10V／cm）跑膠并在UV transillu minator上比較各種不同的單獨(dú)克隆的帶型。

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