制備用于抗原上選擇的噬菌體抗體

       抗體文庫儲存料中制備噬菌體。在開始實(shí)驗(yàn)之前，先用滴定法（在TYE/amp/glu平板上系列稀釋鋪板）計(jì)算每毫升抗體文庫儲存料中細(xì)菌的數(shù)目。在600nm（A600）處的某個(gè)特定吸光值下，抗體文庫中細(xì)菌數(shù)目較未感染細(xì)菌數(shù)目低一些。這或許是因?yàn)楹匈|(zhì)粒的文庫細(xì)菌體積更大，或者是存在死細(xì)菌。一旦滴度與A600確定關(guān)系，吸光值即可用于細(xì)菌數(shù)目的計(jì)算。對于噬菌體的制備（文庫救援），來自文庫儲存料的起始接種量應(yīng)比文庫容量大5倍。接種到培養(yǎng)基后，細(xì)菌濃度的A600不應(yīng)超過0．05。采用文庫容量5倍以上的細(xì)菌接種以確保它能呈現(xiàn)出文庫中的所有成員。而培養(yǎng)起始的A600小于0．05，則可以確保輔助噬菌體加入前處于多倍增長期，以提高輔助噬菌體感染的有效性。用于救援的zui小培養(yǎng)體積必須根據(jù)文庫容量和0．05的zui大起始A600值來確定。例如，含有1．0×l010個(gè)成員的抗體文庫所需要的起始接種量為5．0×l0l0個(gè)細(xì)菌。因?yàn)?．0A600＝1．0×109，為保證起始培養(yǎng)液A600值小于0．05，則需要1L的培養(yǎng)體積。此體積的培養(yǎng)液應(yīng)平均分到兩個(gè)含有250ml 2×TY/amp/glu培養(yǎng)基的2L錐形瓶中。葡萄糖會抑制pⅢ的表達(dá)，但允許纖毛的表達(dá)。

使用新鮮制備的噬菌體才會得到*選擇結(jié)果。這是因?yàn)榧幢阍?80℃下保存，展示抗體也會隨時(shí)間的推移而出現(xiàn)緩慢的蛋白水解。應(yīng)用氯化銫梯度離心法純化菌體，能顯著降低蛋白的水解。這樣純化后，蛋白質(zhì)會非常穩(wěn)定。預(yù)期產(chǎn)量是每毫升原始培養(yǎng)液產(chǎn)生（1～5）×101l個(gè)噬菌體，而氯化銫純化后產(chǎn)量會下降50％。

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