噬菌體DNA/RNA結(jié)合性篩選的標(biāo)準(zhǔn)程序

1．合成需要的靶標(biāo)DNA或RNA寡核苷酸，其中一組是5’端連接生物素的寡核苷酸鏈。為dsDNA位點合成一條不聯(lián)結(jié)生物素的互補(bǔ)副鏈。

2．①對于DNA位點的篩選，將每條寡核苷酸鏈各取10u1，與20/A1的2X核酸退火緩沖液混勻，讓兩條互補(bǔ)的寡核苷酸退火。在PCR儀中以94℃加熱樣品3分鐘，然后以每分鐘2℃的速度冷卻至4℃。冷卻后，用水將溶液稀釋至1pmol/L的終濃度，于-20℃保存。②對于RNA位點篩選，用RNA折疊緩沖液（1XCM）配制1pm01/L的寡核苷酸溶液。將溶液加熱至95℃，然后緩慢冷卻至室溫，以使RNA折疊。對于有些位點，“突然”冷卻至4℃可能折疊效果更好。將RNA溶液保存在4℃（雖然有些位點能成功地冰凍—解凍）。

3．將生物素聯(lián)結(jié)的靶標(biāo)位點（通常是1pmol）加入50,ulPBS緩沖液，加入到鏈親和素包被的小管內(nèi)。將小管于20℃放置15分鐘。    。

4．將1m1含4％（w/v）脫脂牛奶的PBS緩沖液加入小管，以封閉非特異性結(jié)合位點。將小管于20℃放置1小時。

5，將噬菌體上清液以1：10稀釋于1ml含有2％（w/v）脫脂牛奶、1％（體積分?jǐn)?shù)）Tween-20及20ug /ml超聲破碎鮭魚精DNA的PBS緩沖液中。為了提高篩選的特異性，加入與靶標(biāo)同源的寡核苷酸競爭劑。加入與生物素聯(lián)結(jié)的靶標(biāo)相比過量達(dá)100倍的競爭劑。

6，棄去核酸包被的小管中的封閉緩沖液，加入1ml稀釋過的噬菌體上清液。小管于20℃放置1小時。

7．將結(jié)合混合物棄去，用含2％（w/v）脫脂牛奶和l％（體積分?jǐn)?shù)）Tween—20的PBS緩沖液洗滌20次，再用PBS緩沖液單獨洗滌一次。

8，加入100/A1 0．1m01/L的三乙醇胺并放置15秒，以洗脫保留的噬菌體。將溶液轉(zhuǎn)入一個新的小管中，并立即用等體積的1mol/LTris—HCl（pH 7．4）進(jìn)行中和。

9．將過夜培養(yǎng)的菌液以1：100接種于2×TY培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)約2小時以制備處于對數(shù)生長期的大腸桿菌TGl菌液。菌種必須源于M9zui小化瓊脂培養(yǎng)基平板上生長的克隆，這樣才能保證F，纖毛的表達(dá)，因為這是噬菌體感染所必需的。

10．用50ul洗脫的噬菌體感染0．3m1處于對數(shù)生長期的大腸桿菌TGl菌液，混勻后37℃靜置培養(yǎng)1小時。

11．將感染過的菌液轉(zhuǎn)入2～5ml含有15/Ig/m1的四環(huán)素的2XTY培養(yǎng)基中。  以250r/min的速度振蕩菌液，30℃培養(yǎng)16小時，為隨后幾輪的篩選制備噬菌體。

12．重復(fù)從步驟2或3到步驟12的篩選程序3～5輪。在zui后一輪篩選后，將感染的細(xì)菌  涂布在含15ug/m1的四環(huán)素的TYE瓊脂培養(yǎng)基平板上。這時篩選出的克隆已準(zhǔn)備好，可用于通過序列測定和ELISA進(jìn)行的進(jìn)一步的鑒定。