展示DNA結合性蛋白質(zhì)的噬菌體文庫的構想

1 噬菌體展示技術合適嗎?
借助在噬菌體展示技術中使用的絲狀噬菌體，我們關心的DNA結合區(qū)域通常與較小的pⅢ衣殼蛋白融合后進行表達，通過細菌的細胞膜進行轉移，然后被組裝到包裹病毒基因組的噬菌粒顆粒的頭部。zui初的多肽結構域的噬菌體展示實驗，是用諸如抗體、激素或胞外酶之類的分泌性蛋白質(zhì)來進行的，它們本來就可以穿過生物膜并能在氧化性環(huán)境中保持穩(wěn)定；但我們現(xiàn)在知道，很多諸如DNA結合區(qū)域之類的胞內(nèi)結構域，也可以成功地展示在噬菌體表面。即使是這樣，蛋白質(zhì)在細菌中的跨膜轉移偶爾仍然會阻礙某些多肽（特別是那些帶有較高電荷的多肽）的噬菌體展示。核酸結合區(qū)域常常帶正電荷，從而與凈帶負電荷的磷酸二酯鍵形成的骨架相互作用。而我們先前注意到：有些高度堿性的結構域，如BIVTat的zui小的結構域，就不能被展示到噬菌體表面。
另外，在著手于噬菌體展示之前至少還應該考慮兩個其他因素。首先，雖然能被展示的結構域的大小似乎一般沒有限制（見第1章），但這個技術可能于研究較小的基序（10 kDa上下），自然界中有很多這樣的基序。其次，還有一個更嚴格的限制，那就是絕大多數(shù)的天然基序都進化成以非共價結合的二聚體的形式，與回文結構的或近似對稱的DNA字列相結合。雖然用噬菌體展示技術來篩選這樣的基序也是可能的，但其他技術，如細菌的“單雜交”（one-hybrid）方法，可能更適合于這個任務。
2 了解蛋白質(zhì)的DNA結合模式了嗎?
從鋅指結構的噬菌體展示中得到的zui重要的經(jīng)驗之一，就是預先了解蛋白質(zhì)與DNA相互作用的模式可能是非常重要的。一個高分辨率的蛋白質(zhì)—DNA結構顯示了與DNA結合的模式以引起分子間識別的接觸方式，這無疑為這個問題提供了zui大的幫助。一個明顯的需要考慮的因素就是所關心的基序是以單體的形式還是以二聚體的形式與DNA結合的。鋅指結構尤其適合于噬菌體展示，因為它們是以共價連接的串聯(lián)體（concatamer）的形式與DNA結合的，允許對不對稱DNA序列的識別。
另一個需要考慮的因素，是復合體（complex）中的DNA是否以任何方式變形。一個嚴重變形的復合體不意味著噬菌體展示的實驗是不可能的，而可能是預示篩選只可能針對一個有限的DNA序列的子集進行的，或者是預示得到的DNA結合區(qū)域可能是非特異性結合的。從極少量的DNA序列能形成結合所需的結構這個意義上來說，誘導后的蛋白質(zhì)與DNA恰當?shù)南嗷プ饔檬歉叨葘ｉT化的。因此在這些情況中，分子間的識別常常高度依賴于與不直接包含序列信息的DNA骨架的接觸。從Zif268和與其相關的蛋白質(zhì)的晶體結構中可以看到，鋅指結構在幾何結構上適合于結合DNA，不會對雙螺旋結構造成任何較大的混亂。
3 應該隨機突變蛋白質(zhì)的哪一個結構域?
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