制備scFv接頭DNA

●  PCR試劑和設備

●  1ug任何舍有scFv及（GIy₄Ser）₃接頭的載體

●  RHuJ_H引物、RHuVκ引物和RHuVλ引物，10pmol/ul

 

[方法]

1．在0．5ml微量離心管內配制用于擴增的主混合液。所顯示的主混合液用于V_H—Vκ接頭。對于V_H—Vλ接頭的主混合液，n＝29。

                        單個反應主混合液/ul         （n＝25）

●  水                     37                         925

●  10×Vent緩沖液        5．0                        125

●  20×dNTPs             2．5                        62．5

●  Vent DNA聚合酶        0．5                        12．5

2．取24支0．5ml試管，每管分別加入RHuJ_H引物和RHuVκ引物，各2ul。RHuJ_H引物和RHuVκ引物共有24種可能的結合形式。而對于V_H—Vλ接頭，則用RHuVl引物替代RHuVκ引物即可，共可編為28管。如無加熱蓋，可以加入l滴輕質礦物油覆蓋反應液。

3．設1個陰性對照管，加入50ul主混合液。

4．每個樣本取1．0ul scFv基因模板（約1ng），加入到主混合液中。

5．取46u1主混合液分別加入到步驟2已制備的24個管內。

6．預加熱PCR反應格到94℃。

7．以94℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃1分鐘的條件共循環25次，擴增接頭序列。

8．將PCR產物用2．0％TBE瓊脂糖膠電泳純化，切取PCR產物；用Geneclean抽提，并重懸DNA于50ul水中。