電感受態(tài)大腸桿菌TGl的制備

●大腸桿菌TGl菌株（Stratagen）

●37℃孵育箱（NewBrunswickScientmc）

●Sorvatl RC5離心機(jī)（或同類型），GS3轉(zhuǎn)頭（均在4℃預(yù)冷）

●預(yù)冷的500m1聚丙烯離心管

●2L有擋板錐形瓶

●基本培養(yǎng)瓊脂板[10 5g K2HP04、4．5gKH₂P0₄、1g（NH₄）₂S0₄、0．5g Na₃C₆H₅O₇2H₂O、15g瓊脂加水至幾。高壓滅菌，冷卻至錐形瓶微溫；接著加入lml lmol/L MgS0₄、0．5ml 1%維生素B：（硫胺）和10m120%右旋糖。

●2×Y培養(yǎng)基（將16g細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、10g酵母、5g NaCl加入到去離子水中并高壓滅菌）。

●lmol/L Hepes，（N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]），pH 7．4

●lmol/L Hepes，pH 7．4，10%甘油

●10%甘油

 

[方法]

1．將大腸桿菌TG1種到基本培養(yǎng)瓊脂板，37℃過夜。

2．將基本培養(yǎng)瓊脂板上的大腸桿菌TGl再接種到含有15m1 2XTY培養(yǎng)基的100ml形瓶中。37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

3．用5ml夜培養(yǎng)的TGl接種到兩個含500m1 2×Y培養(yǎng)基的2L有擋板錐形瓶中。在搖床中培養(yǎng)約1．5小時，直到A₆₀₀接近0．5。

4．將菌液轉(zhuǎn)移4個預(yù)冷離心瓶中（約250ml/瓶）。平衡后，置于冰上20分鐘。

5．以3000g，4℃離心15分鐘。使用前預(yù)冷所有轉(zhuǎn)頭。

6，棄去上清，并以起始體積的冰冷lmmol/L Hepes溶液（約250m1）重懸每個錐形瓶中的細(xì)胞。所有溶液都應(yīng)當(dāng)新鮮配置。

7．再次以3000g，4℃離心15分鐘。

8．以一半起始體積的冰冷lmmol/L Hepes溶液（約125ml）重懸每個錐形瓶中的細(xì)胞；此時可合并到兩個離心瓶中。

9．再次以3000g，4℃離心15分鐘。

10．以總體積為20m1的10%甘油和lmm01/L Hepes混合液重懸所有細(xì)胞。

11．再次以3000g，4℃離心15分鐘。

12．如果細(xì)胞不是新鮮使用而是儲存，則需準(zhǔn)備乙醇/干冰浴。

13．以總體積為2m1的10%甘油重懸細(xì)胞。

14．使用新鮮制備的細(xì)胞，或者用干冰浴等量分裝凍存細(xì)胞②。在檢測效率后，及時使用細(xì)胞（在1周內(nèi)）。

用于電轉(zhuǎn)化的DNA不得含有鹽分。細(xì)菌/DNA混合物中如有鹽分可導(dǎo)致電弧（一種短路）的形成，應(yīng)加以避免。總體上，在70℃10分鐘的熱滅活步驟后，可使用2/Il標(biāo)準(zhǔn)連接液進(jìn)行連接。為構(gòu)建抗體文庫，所用DNA必須使用酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀法或選擇合適的試劑盒（例如Geneclean或Qiagen）進(jìn)行純化。