TeloTAGGG™ 端粒長(zhǎng)度檢測(cè)試劑盒

端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的特殊DNA蛋白結(jié)構(gòu)，由小串聯(lián)重復(fù)DNA序列組成。已有許多端粒序列經(jīng)過(guò)鑒定，顯示其具有非常少的序列變異，甚至是在系統(tǒng)發(fā)育存在差異的生物體之間，如四膜蟲(chóng)（序列：TTGGGG)和人類(lèi)（序列：TTAGGG)。
由于DNA聚合酶不能復(fù)制線性DNA的末端，因此，有人認(rèn)為每個(gè)復(fù)制周期都會(huì)導(dǎo)致染色體末端逐漸縮短（稱(chēng)為“末端復(fù)制問(wèn)題"）。已在體外和體內(nèi)經(jīng)過(guò)證實(shí)的這種現(xiàn)象，似乎與正常體細(xì)胞的有限增殖能力（“有絲分裂鐘"）有關(guān)。由于生殖細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出具有延長(zhǎng)甚至無(wú)限的壽命，因此有人提出這些細(xì)胞必須具有維持端粒長(zhǎng)度的特定機(jī)制。
保持穩(wěn)定的端粒長(zhǎng)度與端粒酶的激活有關(guān)。該酶是一種核糖核蛋白，利用其內(nèi)在RNA組分作為DNA合成的模板，通過(guò)在染色體末端添加重復(fù)序列來(lái)補(bǔ)償端粒DNA的丟失。
端粒通過(guò)與結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，對(duì)維持真核細(xì)胞內(nèi)染色體的穩(wěn)定性具有重要作用。這些蛋白質(zhì)可以封閉線性染色體的末端，防止核降解、染色體末端融合、不規(guī)則重組以及其他通常對(duì)細(xì)胞致命的事件。
對(duì)人類(lèi)外周血單核細(xì)胞研究樣本中端粒長(zhǎng)度的分析揭示了端粒長(zhǎng)度隨供體年齡的增加而降低，反映了這些細(xì)胞的復(fù)制史。已在多種疾病（如，唐氏綜合征、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張和HIV感染）中發(fā)現(xiàn)存在端粒丟失加速的現(xiàn)象，表明端粒長(zhǎng)度縮短可能與這些疾病相關(guān)的免疫功能障礙有關(guān)。該試劑盒用于進(jìn)一步了解關(guān)于這些關(guān)系的科學(xué)知識(shí)。

分析時(shí)間：約18小時(shí)
樣品材料：細(xì)胞培養(yǎng)物和其他生物樣品

用于測(cè)定端粒長(zhǎng)度的非放射性化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法。

該試劑盒對(duì)末端限制性片段（TRF）進(jìn)行Southern分析，這些片段是利用頻繁切割限制性?xún)?nèi)切酶消化基因組DNA而獲得的。
第1步：基因組DNA的消化
使用優(yōu)化的頻繁切割限制性?xún)?nèi)切酶混合物消化純化的基因組DNA。選擇的酶不會(huì)切割端粒DNA和亞端粒DNA。這是因?yàn)橹貜?fù)序列具有特殊序列特征。非端粒DNA被消化成低分子量片段。
第2步：凝膠電泳和Southern印跡
在DNA消化后，通過(guò)凝膠電泳分離DNA片段，然后通過(guò)Southern印跡將其轉(zhuǎn)印至尼龍膜上。
第3步：雜交和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)
轉(zhuǎn)印的DNA片段與端粒重復(fù)序列的特異性DIG標(biāo)記探針雜交，然后使用與堿性磷酸酶共價(jià)連接的DIG特異性抗體孵育。最后，使用堿性磷酸酶的高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物CDP-Star，使固定的端粒探針顯色。通過(guò)對(duì)比信號(hào)與分子量標(biāo)準(zhǔn)品，可確定平均TRF長(zhǎng)度。

TeloTAGGG^™ Telomere Length Assay被設(shè)計(jì)用于以下生命科學(xué)研究應(yīng)用:

• 靈敏檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物和其他生物研究樣品中的端粒DNA（端粒序列：TTAGGG)[1]

• 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物和其他生物研究樣品中DNA的端粒長(zhǎng)度[2][3][4]

1個(gè)試劑盒包含15種組分。

探針的序列和長(zhǎng)度保密。試劑盒中的DIG標(biāo)記MW是DIG MW III和VII的混合物

工作濃度：結(jié)合物的工作濃度取決于應(yīng)用和底物

以下濃度應(yīng)作為使用指南：

• 斑點(diǎn)雜交印跡：100 ng/ml

• ELISA：100 ng/ml

• 蛋白質(zhì)免疫印跡：100 ng/ml

工作濃度：TAE緩沖液
0.04 M Tris-乙酸，0.001 M EDTA，pH 8.0
HCl溶液
0.25 M HCl
一個(gè)200 cm² 的印跡需要約250 ml溶液。
變性 溶液
0.5 M NaOH，1.5 M NaCl
一個(gè)200 cm² 印跡需要約500 ml溶液。
中和液
0.5 M Tris-HCl,3 M NaCl,pH 7.5
一個(gè)200 cm² 印跡需要約500 ml溶液。
20x SSC
3 M NaCl,0.3 M檸檬酸鈉,pH 7.0
2x SSC
使用經(jīng)高壓滅菌的重蒸水稀釋20x SSC(溶液5)，稀釋比例為1:10。
DIG Easy Hyb雜交顆粒
使用64 ml經(jīng)高壓滅菌的重蒸水重懸顆粒（瓶8），并在37 °C孵育至全重懸。臨用前幾小時(shí)制備溶液。
嚴(yán)格洗滌緩沖液I
2x SSC，0.1% SDS
嚴(yán)格洗滌緩沖液II
0.2x SSC，0.1% SDS
洗滌緩沖液，1x
使用經(jīng)高壓滅菌的重蒸水稀釋適量的洗滌緩沖液10倍濃縮液（瓶10），稀釋比例為1:10。
封閉液，1x
使用1x馬來(lái)酸緩沖液（溶液12）稀釋適量的封閉液10倍濃縮液（瓶12），稀釋比例為1:10。
馬來(lái)酸緩沖液，1×
使用經(jīng)高壓滅菌的重蒸水稀釋適量的馬來(lái)酸緩沖液10倍濃縮液（瓶11），稀釋比例為1:10。
DIG-AP抗體，工作溶液
為減少聚集抗體產(chǎn)生的背景，請(qǐng)?jiān)谑褂们皩⒃噭┢恳?3,000 rpm離心5分鐘。
使用1x封閉液（溶液11）將適量DIG-AP抗體（瓶13）溶液稀釋至終濃度為75 mU/ml (1:10,000)。
檢測(cè)液，1x
使用經(jīng)高壓滅菌的重蒸水稀釋適量的檢測(cè)液10倍濃縮液（瓶14），稀釋比例為1:10。
儲(chǔ)存條件（工作溶液）：TAE緩沖液：
在15至25 °C下穩(wěn)定保存
HCl溶液
在15至25 °C下穩(wěn)定保存
變性 溶液
在15至25 °C下穩(wěn)定保存
中和液
在15至25 °C下穩(wěn)定保存
20x SSC
在15至25 °C下穩(wěn)定保存
2x SSC
在15至25 °C下穩(wěn)定保存
DIG Easy Hyb雜交顆粒
在15至25 °C下穩(wěn)定保存3個(gè)月
嚴(yán)格洗滌緩沖液I
在15至25 °C下穩(wěn)定保存
嚴(yán)格洗滌緩沖液II
在15至25 °C下穩(wěn)定保存
洗滌緩沖液，1x
在15至25 °C下穩(wěn)定保存
封閉液，1x
臨用前配制。請(qǐng)勿儲(chǔ)存
馬來(lái)酸緩沖液，1×
在15至25°C下穩(wěn)定保存。
DIG-AP抗體，工作溶液
臨用前配制。請(qǐng)勿儲(chǔ)存
檢測(cè)液，1x
在15至25°C下穩(wěn)定保存