平衡法選擇高親和力噬菌體抗體

1．多樣化的噬菌體抗體丈庫中制備噬菌體抗體。
2．根據(jù)廠家說明，對抗原進行生物素化。
3．選擇前，在1個1．5m1微量離心管中．用2％MPBS 1m1封閉150ul鏈霉親和素磁珠，室溫1小時。用磁性試管架將碰珠吸向一側(cè)。棄去緩沖液。
4．用2％MPBS封閉3個1．5m1微量離心管，室溫1小時；而后，棄去封閉緩沖液。以3個不同濃度將士物素化抗原（總共3管）與溶于2％MPDS（終濃度）的1m1噬茼體樣品（大約1012c{u／m1）進行孵育，室溫振蕩l小時。對于*輪選擇，抗原濃度應(yīng)分別為Kd／l、Kd／10以及Kd／100；此處Kd＝針對抗原的野生型抗體親和力。
5．每管加入50u1鏈霉親和素化磁珠并在轉(zhuǎn)臺上孵育，室溫15分鐘。將試管放入磁架30秒。磁珠將移向磁體。
6．抽吸上清，讓磁珠留在微量離心管一側(cè)。是用200u1吸頭套在巴氏吸管上，再接 到真空源上進行。用PBS／Tween洗滌磁珠7次（每次洗滌用lml），接著用MPBS洗滌2次，再用PBS洗滌1次。每隔一次洗滌就將磁珠轉(zhuǎn)移到1個新的1．5m1試管中，以充分洗滌。
7．用100u1 100mmol／L HCl將噬菌體從磁珠上洗脫下來，室溫10分鐘。將試管放入磁架30秒，沉淀磁珠。移取含有洗脫的噬茼體上清，并用1m11inol／L Trls（pH 7．4） 中和。冰上保存洗脫液。
8．將0．75m1洗脫噬菌體加入到10ml對數(shù)生長的大腸桿菌TGl（A600約0．5） 中。4℃下儲存剩余的洗脫噬菌體。
9．37℃下靜置孵育洗脫物—大腸桿菌混合液，30分鐘。
10．將1ul和10ul感染的TGl細胞在100mmTYE／amp／glu平板上鋪板接種，滴定洗脫液（稀釋比例分別為104和103）。
11．離心剩余的細菌培養(yǎng)液，2700g 10分鐘。將沉淀重懸于250ul 2×TY中，并在2個150mmTYE／amp／R1u平板上鋪板，37℃孵育過夜。
12．次晨，每個平板加入3m1 2×TY／amp／glu，再用彎曲玻璃棒自平板上刮取細菌。將1．4ml菌液與0．6m1 50％的甘油（無菌過濾）混合制備甘油儲存料。-70℃下保存。分析產(chǎn)出滴定結(jié)果（步驟9）以確定哪個（從抗原農(nóng)度＝Kd／1、Kd／l0以及Kd／100）確定出相應(yīng)的噬菌體以用于下一輪選擇的改良。過去，我們依據(jù)噬菌體EUSA測定的結(jié)合性克隆陽性率或依據(jù)BIAcore測定的活性噬菌體濃度，進行判斷。不過根據(jù)經(jīng)驗，可以通過分析產(chǎn)出滴度作出選擇： 當產(chǎn)出滴度比抗原濃度下降更明顯時（即當比較來自Kd／l、Kd／10以及Kd／100的3個產(chǎn)出滴度時），一般是結(jié)合減少的結(jié)果，那么此濃度下的噬茵體不應(yīng)用于后續(xù)的選擇。而應(yīng)當用較高抗原濃度的噬菌體替代。我們每輪把抗原濃度平均降低大約90％倍，而在親和力成熟的zui后一輪常常使用飛摩爾的的抗原濃度。
13．從來自步驟ll的合適的甘油儲存料中制備噬菌體抗體；從本實驗方案步驟1重復(fù)進行。

www.sydney4dlotto.com