抗體的易接近性

 

依據研究抗原的特性和其制備的方法，有些表位不易與抗體接近?？贵w所識別的同源表位空間封閉的zui常見原因是：①其他分子的存在，特別是已經結合在抗原分子上的蛋白質或核酸可競爭性接近表位；②蛋白質抗原的修飾，特別是由細胞調節(jié)控制的蛋白質磷酸化；③如同在細胞或組織染色中發(fā)現(xiàn)的復合物中抗原定位問題。

 

(一)多聚體相互作用

    一種類型的封閉是由結合在抗原分子上的其他分子所引起的，這種情況是由于蛋白—蛋白分子間的相互作用。如果在研究中抗體識別的表位與相互作用的蛋白結合位點重疊，就檢測不到抗體—抗原間的相互結合。這可以作為一種方法來測定蛋白—蛋白分子間是否存在相互作用。這種表位競爭幾乎在任何分子間相互作用中都可以發(fā)現(xiàn)，但zui常見的是相關大分子間的相互作用，例如蛋白質或者核酸。多聚體相互作用是免疫染色、免疫沉淀和免疫親和純化中常見的問題，但對免疫印跡來說則不多見，因為該技術中在

抗體加入之前抗原已經*變性。

在不同免疫化學技術中抗體達到易接近性

對特異的抗體—抗原來說，多聚體相互作用是影響抗體識別表位的重要因素，所以通常情況下更換一個識別不同表位的抗體即可解決。如果缺乏有關不同抗體結合位點的準確信息，簡單的方法是用抗體進行檢測。由于多克隆抗體通常在多個位點識別抗原，因此與抗原的結合占優(yōu)勢，故多抗在解決多聚體相互作用問題時成為。解決這個問題的第二種辦法是在加入抗體之前破壞多聚體的相互作用。絕大部分蛋白—DNA、蛋白-RNA以及蛋白—蛋白分子間的相互作用，可以通過加入400mmol／L或更高濃度的鹽就能破壞，同時也破壞了抗原的結構，但絕大部分抗體對抗原仍保持活性。對于多聚體更強的相互作用，可采用更劇烈的條件來破壞抗原—競爭物之間的關系。

 

(二)蛋白質抗原翻譯后的修飾

    阻礙抗體與同源蛋白質抗原結合的另一因素是翻譯后的修飾，這種情況以蛋白磷酸化zui為常見，它能封閉某些單抗與抗原結合。由于這是影響細胞或細胞群內蛋白的亞單位，通常情況下這種抗原結構的空間變化只會減少信號的強度。然而在某些情況下抗原可被*修飾，從而阻礙了抗體與相應抗原的結合。可以更換抗體或用酶處理蛋白質抗原除去修飾來解決這一問題，例如在蛋白質抗原磷酸化的情況下可用磷酸酶處理。

(三)定位

    抗體易接近性的第三類問題是由抗原定位引起，例如免疫染色。如果抗原被包埋在一個復合物結構中，或者由于一個障礙性的細胞結構，從物理性狀上講抗體不易與抗原結合，這是細胞或組織染色中*的問題。

    解決這類問題比較困難，需要分別對待，因為在每一種情況下阻礙抗體達到抗原的機制是不一樣的，均需要作為一個單獨的問題來考慮。解決這些抗體易接近性的各種方法都涉及采用某些物理手段破壞干擾結構。zui常用的兩種方法是部分蛋白溶解和微波處理。部分蛋白溶解是有目的地去除抑制結構而使靶抗原不受影響，為使蛋白溶解更加有效，需要調節(jié)蛋白酶的用量及孵育時間。通過固定方法可以提供某些幫助，因為從物理上講抗原的許多區(qū)域是通過交聯(lián)結合在鄰近結構上的，所以即使發(fā)生某種抗原的蛋白溶解剪接，至少部分抗原仍連接在其他局部結構上。雖然如此，只有在空間上達到易接近性才是一個有效的方法。

    達到易接近性的第二個常用辦法是用微波處理樣本，適當地通過細胞結構部分變性以達到目的。但需要仔細調節(jié)微波處理的時間和強度，以便使抗體達到易接近性，但又不破壞抗原或可識別的細胞形態(tài)學。