再擴(kuò)增scFv基因文庫(kù)以添加限制性位點(diǎn)進(jìn)行克隆

[器材和試劑]
● PCR試劑和設(shè)備。除了用Taq聚合酶緩沖液替代Vent聚合酶緩沖液。各自在適宜緩沖液中保存的Tdg聚合酶，均可使用。
● V區(qū)特異性正向 （3’）（JκFORNot和JλFORNot）和反向（5’） （VHBACKSfi PCR引物
● 已組裝的scFv基因文庫(kù)
● Wizard PCR純化試劑盒（Promega）

[方法]
1．在0．5ml微量離心管中，配制兩個(gè)50/z1PCR反應(yīng)混合液（1個(gè)用于VH—VκscFv文庫(kù)， 另1個(gè)用于Vu—Vλ scFv文庫(kù)），其中含有：
● 水，36．5//1
● 10XTag緩沖液，5．0ul
● 20XdNTP， 2．5ul
● 正向引物，2．0ul
● 反向引物，2．0ul
● scFv基因文庫(kù)（約long）， 1．0ul
2．在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱反應(yīng)管到94℃，5分鐘。如果沒(méi)有加熱蓋，則滴加1滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液。
3．加入1．0ul（5單位）TdQDNA聚合酶。
4．以94℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘的條件共循環(huán)25次，擴(kuò)增scFv基因。
5．用Wizard PCR純化試劑盒，純化PCR產(chǎn)物。

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