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          用多聚甲醛固定懸浮細胞

          更新時間:2012-02-10點擊次數:14987
          所有的固定方案必須做到:①防止抗原丟失;②透化細胞以便使抗體進入;③盡量使抗原保持能與抗體結合的狀態;④維持細胞正常結構。
           
              常用的固定劑種類很多,固定劑的正確選擇取決于被研究抗原的性質及所用抗體的特性。固定劑可分為兩大類:有機溶劑和交聯劑。有機溶劑如乙醇和丙酮能夠去除脂類物質使細胞脫水,把蛋白質沉淀在細胞結構上。交聯劑一般通過自由氨基基團把生物分子橋連起來,形成一個相互連接的抗原網。兩種方法均使蛋白質抗原部分變性。因此,在細胞染色中,能夠識別變性蛋白的抗體更加有用。在某些情況下,只有用此類抗體才能得到滿意的結果。
           
              往往憑經驗選擇固定劑。雖然許多人發現用交聯劑固定細胞可以獲得較好的結果,但沒有通用規則可以參考。可以試用兩種方法,然后選擇較好的一種。
           
              懸浮細胞染色通常用于檢測細胞表面抗原。因為細胞呈懸浮狀態,洗滌過程復雜,因此,應注意離心時間不要過長或轉速太高。
           
              1.所需溶液
              4%多聚甲醛(臨用前配制)、PBS。
           
              2.操作步驟
              (1)PBS配制4%多聚甲醛;
              (2)用PBS洗滌細胞2次,用200g離心5min;重懸細胞。
              (3)小心用4%多聚甲醛溶液懸浮細胞,細胞濃度約為1X106/m1 15min,間或搖動;
              (4)200g離心5rain,用PBS重懸細胞,重復洗滌細胞2次;室溫下靜置
              (5)用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化細胞2min(室溫),有的抗原需15min,具體時間視抗原而定;
              (6)200g離心5rain,用PBS重懸細胞,重復洗滌細胞2次。 
              此時的細胞標本可用于后續的抗體檢測。
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